ГОСТ 31475-2012 Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли растительного (соевого) белка методом электрофореза, блок 4

8 Проведение исследования

8.1 Проведение электрофореза

8.1.1 В соответствии с инструкцией по эксплуатации собирают камеру для проведения вертикального электрофореза.

8.1.2 Подготовка кассеты и заполнение ее нижним сепарирующим (рабочим) и верхним формирующим гелем

Два чистых стекла, входящих в комплект камеры для электрофореза, обезжиривают этиловым спиртом. Затем их закрепляют в кассету с заданным расстоянием между стеклами 1 мм, образуя пространство для заливки геля размером 115х115х1 мм. Затем осторожно по краю стекла через наконечник от пипеточного дозатора заливают состав для нижнего сепарирующего геля на три четверти высоты стекла. В кассету по стенке на поверхность залитого геля приливают дистиллированную воду для полимеризации геля и выравнивания верхнего края его поверхности. После полимеризации граница между гелем и водой должна быть четко видна. Процесс происходит при температуре 20°С в течение 1 ч. Увеличение времени полимеризации приводит к получению более плотной сетки геля и возрастанию времени, необходимого для проведения электрофореза.

После полимеризации воду сливают и сверху через пластиковый наконечник от пипеточного дозатора заливают формирующий гель. Гель заливают в кассету на поверхность ранее полученного геля до верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят повторно полимеризацию в течение 20-30 мин. Для достижения лучшего разделения белковых полос кассету с гелем можно выдержать в течение 10 ч при 4°С. После этого гребенку следует удалить.

8.1.3 В соответствии с инструкцией по эксплуатации кассету закрепляют в электрофорезной камере, туда же помещают электроды, спираль для охлаждения буфера и заливают в электродную камеру до краев электродный буфер так, чтобы буферный раствор покрывал верхний край кассеты с гелем.

После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2 растворы белковых проб в количестве 1-2 мкл, содержащих белок из расчета 10-20 мкг на одно углубление. Допускается максимально вносить в одно углубление 20 мкл раствора белка. Введение проб осуществляют медленно, так, чтобы вводимый раствор белка не всплывал со дна углублений.

В отдельное углубление рядом с анализируемой пробой вносят 5 мкл раствора маркерных белков с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл, приготовленного по 7.1.8.

Включают электрический ток и проводят процесс при плотности постоянного тока 2,5 мА/см в течение 1-2 ч.

Время процесса зависит от состояния геля (насколько свежими были использованные растворы), а также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.

8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне углублений верхнего геля, затем продвигаются вниз. Происходит формирование молекул белка под воздействием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС - реактива, способствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную денатурацию).

При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя бромфенолового синего.

После прохождения белков через верхний гель полосы собираются на границе двух гелей, входят в нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).

Путь, который проходит каждая полоса , прямо пропорционален молекулярной массе белковой фракции.

8.1.5 Процесс завершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются примерно в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают. Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, выдерживают 15 мин, сливают кислоту и промывают дистиллированной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обесцвечивающем растворе в течение 3 ч.

В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет полосы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам с известной молекулярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям растительного происхождения.

8.1.6 Повторяют анализ со второй параллельной пробой.

8.2 Определение массовой доли соевых белков

8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой пробе.

9 Обработка результатов

9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

,                                                  (1)

где и - результаты параллельных определений массовой доли соевых белков, определенные по градуировочному графику, %;

- предел повторяемости, приведенный в таблице 1.

Результат вычислений округляют до целого числа.

9.2 Массовую долю растительного соевого белка , %, относительно массовой доли общего белка, вычисляют по формуле

,                                                                       (2)

где - среднеарифметическое значение массовой доли растительных белков в анализируемом образце, %;

- значение массовой доли общего белка в анализируемом образце, определенное методом Кьельдаля по ГОСТ 25011, %.

10 Требования безопасности

10.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

10.2 Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

10.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.

Далее