ГОСТ 31475-2012 Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли растительного (соевого) белка методом электрофореза, блок 3

 7 Подготовка к выполнению измерений

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дмВ мерную колбу вместимостью 1000 см количественно переносят содержимое вскрытой ампулы со стандарт-титром соляной кислоты 0,1 моль/дм, дополнительно ополаскивают ампулу дистиллированной водой, переносят в колбу и доводят дистиллированной водой объем раствора до метки.

7.1.2 Приготовление раствора ТРИС-буфера рН 6,8 для солюбилизации белков

7.1.2.1 Приготовление раствора 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) молярной концентрации 0,1 моль/дмНавеску 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 1,211 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.2.2 В мерную колбу вместимостью 50 см помещают 25 см раствора ТРИС молярной концентрации 0,1 моль/дм, добавляют 22,5 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм и доводят дистиллированной водой до метки.

7.1.3 Приготовление растворов для электрофореза

7.1.3.1 Приготовление раствора Навеску акриламида массой 30 г и навеску N, N’-метиленбисакриламида (МБА) массой 0,15 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.2 Приготовление раствора Навеску ТРИС массой 18,2 г и навеску додецилсульфата натрия (СДС) массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН=8,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.3 Приготовление раствора Навеску ТРИС массой 9,1 г и навеску СДС массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН=6,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.4 Приготовление раствора Навеску аммония персульфата (АПС) массой 0,125 г растворяют в 1,23 см дистиллированной воды.

7.1.3.5 Приготовление раствора Навеску акриламида массой 30,0 г и навеску МБА массой 0,8 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в 50-60 см дистиллированной воды и доводят дистиллированной водой до метки.

7.1.4 Приготовление электродного буфера 1:4

7.1.4.1 Приготовление 20%-ного раствора СДС

Навеску СДС массой 20,0 г смешивают в химическом стакане с 80 см дистиллированной воды до полного растворения соли.

7.1.4.2 В мерную колбу вместимостью 2 дм помещают навеску 24,0 г ТРИС и навеску 115,0 г глицина, добавляют 40 см 20%-ного раствора СДС, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения компонентов.

7.1.5 Приготовление окрашивающего раствора для геля

К навеске красителя Кумасси R-250 массой 1,1 г приливают 200 см этилового спирта, 50 см уксусной кислоты, 200 см дистиллированной воды и перемешивают в химическом стакане до полного растворения.

7.1.6 Приготовление обесцвечивающего раствора

К 500 см этилового спирта приливают 350 см уксусной кислоты и 2 дм дистиллированной воды.

7.1.7 Приготовление буфера для растворения белковых проб

7.1.7.1 Приготовление 0,05%-ного раствора бромфенолового синего

Навеску 0,05 г бромфенолового синего смешивают в химическом стакане с 99,95 см дистиллированной воды.

7.1.7.2 К 0,4 см 2-меркаптоэтанола поочередно приливают 0,8 см 20%-ного раствора СДС, 0,4 см ТРИС-буфера, 0,8 см 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 5 см дистиллированной воды и 5 см глицерина.

Растворы используют свежеприготовленные, допускается их хранение при температуре 4°С не более двух суток.

7.1.8 Приготовление раствора маркерных белков с молекулярной массой 27000-180000 с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл

В пластиковой пробирке типа "Эппендорф" растворяют навеску массой 50,0 мкг готовой смеси маркерных белков с молекулярной массой 27000-180000 в 50,0 мкл буфера для растворения белковых проб. Раствор сохраняют при минус 20°С в течение одной недели.

7.1.9 Приготовление фиксирующего раствора

Навеску 12,5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в химическом стакане в 87,5 см дистиллированной воды и получают 12,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

7.1.10 Приготовление растворов для получения полимерного геля

7.1.10.1 Приготовление раствора для нижнего сепарирующего геля

18,0 см раствора , 7,5 см раствора , 4,3 см дистиллированной воды, 0,01 см ТЕМЕД, 0,2 см раствора смешивают в химическом стакане непосредственно перед использованием.

7.1.10.2 Приготовление раствора для верхнего формирующего геля

В химическом стакане смешивают 1,3 см раствора , 2,5 см раствора , 6,2 см дистиллированной воды, 0,01 см ТЕМЕД, 0,1 см раствора .

Растворы используют немедленно после приготовления.

7.2 Проведение экстракции

Навеску образца, содержащего около 0,2 г общего белка, определенного предварительно методом Кьельдаля по ГОСТ 25011 (для мясных продуктов при массовой доле общего белка 18% масса навески составляет 1,0 г), гомогенизируют в микроизмельчителе или путем растирания в ступке с 10 см ТРИС-буфера рН 6,8 или буфера для растворения белковых проб (в случае плохой растворимости). Затем нагревают смесь до 75°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Прозрачную надосадочную жидкость используют для проведения электрофореза.

7.3 Приготовление смесей для градуировочного графика

Навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины, содержание животного белка не менее 18%) смешивают с навесками 1, 5, 10, 15, 20, 50 и 85 г соевого изолята, содержащего не менее 85% растительного белка.

Точное содержание растительного и животного белка предварительно устанавливают методом Кьельдаля по ГОСТ 25011. Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Получают двухкомпонентные модельные мясорастительные смеси, массовая доля растительного соевого белка в которых относительно массовой доли общего белка равна соответственно 4,5%; 19,1%; 32,1%; 41,5%; 48,6%; 70,2% и 80,0%.

7.4 Построение градуировочного графика

7.4.1 Проводят денситометрирование выявленных характеристических белковых полос, соответствующих молекулярным массам 65000-75000, и автоматически, используя показания денситометра, вычисляют сумму площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000-75000.

Сумма площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000-75000, пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.

Градуировочный график строят по результатам определения массовой доли соевых белков в двухкомпонентных модельных мясорастительных смесях, приведенным в таблице 2.

Таблица 2

График, построенный по данным таблицы 2, представлен в приложении А.

Далее